Według legendy kościół został zbudowany w miejscu, w którym w XIV wieku zginęli trzej strażnicy wielkiego księcia litewskiego Olgierda: Antoni, Jan i Eustacjusz. Zostali oni powieszeni w dębowym gaju, gdzie przestępcy zostali straceni za przyjęcie chrześcijaństwa i otwarte głoszenie go wśród pogańskiej ludności Litwy. Kilka lat później prawosławni chrześcijanie zaczęli gromadzić się tutaj na modlitwach. Wkrótce liczba pielgrzymów znacznie wzrosła i wtedy postanowiono zbudować małą kaplicę, a później wzniesiono drewniany kościół pod wezwaniem Świętej Trójcy.
Na początku XVI wieku cerkiew Trójcy Świętej niszczał i zamieniał się w ruiny. W 1516 r. wielki książę litewski Zygmunt I zezwolił hetmanowi Konstantemu Ostrogskiemu na zburzenie pozostałości dawnego drewnianego kościoła i zbudowanie nowej kamiennej cerkwi w dowód wdzięczności za zwycięstwo w bitwie pod Orszą w 1514 roku. Konstanty Ostrożski nie ograniczył się do kościoła i zbudował obok niego klasztor o tej samej nazwie.
W 1608 r. cerkiew Świętej Trójcy została przekazana unitom. W latach 1622-1624 dobudowali oni do bocznych fasad jeszcze dwie kaplice i zakrystię. Ponadto, po prawej stronie od wejścia, kosztem wojewody wileńskiego J.S. Tyszkiewicza, zbudowali dodatkową kaplicę, która została oświetlona na cześć wstawiennictwa Przenajświętszej Bogurodzicy.
W 1706 r. kościół został poważnie uszkodzony przez pożar, zwłaszcza kaplica Wniebowstąpienia Krzyża Świętego, zbudowana po lewej stronie od wejścia, która została zaadaptowana na klasztor unicki. 42 lata później, w 1748 r., cerkiew Trójcy Świętej ponownie spłonął, a następnie, w 1761 r., został odrestaurowany w stylu barokowym według projektu wileńskiego architekta Jana Krzysztofa Glaubitza. W 1792 r. odnowiono elewacje boczne, a zamiast ściany zachodniej wykonano dobudówkę, która znacznie wydłużyła kościół.
Kolejne prace remontowe w cerkiew Trójcy Świętej przeprowadzono pod zarządem duchowieństwa prawosławnego, któremu został przekazany w 1839 roku. W latach 1851-1852 za prace remontowe odpowiedzialny był architekt M. Prozarov. W 1869 r. fasada została przebudowana według projektu architekta M. Chagina. W 1878 r. na końcu zachodniej ściany wzniesiono dwie wieżyczki.
Obecnie świątynia stanowi zespół budowli, zawierający fragmenty gotyku, baroku i klasycyzmu. Początkowo budynek kościoła Świętej Trójcy miał plan niemal kwadratu, z wieżami na narożach. Ściany wzmocniono przyporami, a aspiraty i wschodnie wieże ozdobiono łukowym pasem. Do budowy kościoła użyto ciemnoczerwonych i żółtych cegieł, układanych zgodnie z techniką gotycką. Obok kościoła, na północnym zachodzie, znajduje się dzwonnica, do której wejście znajduje się na znacznej wysokości, co oczywiście wskazuje na obronne przeznaczenie tej budowli.
Obecnie cerkiew Trójcy Świętej w Wilnie należy do Kościoła unickiego. Nabożeństwa odprawiane są w języku ukraińskim i białoruskim.